Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中最常用的一种实验方法，WB的原理很简单——各电泳分离的细胞或组织蛋白转移到PVDF/NC膜上，用特定抗体结合蛋白抗原，再结合标记的二抗似化学发光的方式可视化地将蛋白表达情况呈现在人们面前。
常见问题举例分析：1、蛋白电泳条带异常
“微笑”条带
条带拖尾
条带模糊
原因:凝胶不充分;电压过高;温度过高;电泳速度过快
建议:待充分凝胶后再电泳;降低电压;低温电泳:减慢电泳速度
原因:凝胶浓度过高;电泳缓冲液失效，蛋白降解
建议:重新配制电泳缓冲液;降低凝胶浓度:
原因:蛋白未完全变形:电泳太快;转膜问题
“皱挦褙萌烬➅鷴餃肷巻圕ㄎォ糖带
原因:凝胶与玻璃挡板质之间有气泡
建议:在两板间加入适量缓冲液以排除气泡
垂直纹理
原因:样品裂解不充分;样品有不溶性颗粒;蛋白降解
建议:加样前离心样品:优化蛋白提取方法，寻找合适裂解液
建议:完全变性蛋自样品、降低电泳时间、电泳之后及时将凝胶浸泡在转膜液中
2、转膜不成功
膜上无大分子条带
原因:转膜时间短;蛋白太大转不过去
建议:转膜条件(延长时间)、选择湿
转(半干转不适合大分子条带)、选择
NC膜，降低凝胶浓度
膜上无小分子条带
原因:膜孔径大于蛋白，转膜时间过长建议:减少转膜时间，选择PVDF膜
膜上无条带
原因:操作原因;膜的选择不适合
蛋白与膜的结合能力弱
建议:检查转膜条件、选取合适的膜
蛋白条带转到滤纸上
原因:电压过高;时间过长;膜的孔径太大
建议:降低电压，减少转膜时间，选择合适的膜
同一位置出现多条带
为什么同一位置出现多条带?
原因-1:目标蛋白具有多种修饰形式
·磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等不同修饰作用在同一关键通路枢纽靶标上
原因-2:蛋白表位相似但结构不同
·新检测出文献未报到蛋白或同一家族蛋构型不同，或是细胞株纯度不够
原因-3:细胞传代过多，蛋白表达异常
·多次传代发生基因组素乱，二倍体消失或其他编码表达异常的现象
处理方法-1
，结果正常
处理方法-2
√ 接受该结果作为分析讨论的对象
处理方法-3
√ 更换细胞株或重新分离原代细胞
原因-4:目标蛋白有多聚体
非单体结构的蛋白，在SDS-PAGE前的沸煮时间不足，导致蛋白解聚不充分
处理方法-4
√ 充分做好课题调研，了解目标蛋白特性和结构
优化样品处理方式
常见问题举例分析：1、蛋白电泳条带异常
“微笑”条带
条带拖尾
条带模糊
原因:凝胶不充分;电压过高;温度过高;电泳速度过快
建议:待充分凝胶后再电泳;降低电压;低温电泳:减慢电泳速度
原因:凝胶浓度过高;电泳缓冲液失效，蛋白降解
建议:重新配制电泳缓冲液;降低凝胶浓度:
原因:蛋白未完全变形:电泳太快;转膜问题
“皱挦褙萌烬➅鷴餃肷巻圕ㄎォ糖带
原因:凝胶与玻璃挡板质之间有气泡
建议:在两板间加入适量缓冲液以排除气泡
垂直纹理
原因:样品裂解不充分;样品有不溶性颗粒;蛋白降解
建议:加样前离心样品:优化蛋白提取方法，寻找合适裂解液
建议:完全变性蛋自样品、降低电泳时间、电泳之后及时将凝胶浸泡在转膜液中
2、转膜不成功
膜上无大分子条带
原因:转膜时间短;蛋白太大转不过去
建议:转膜条件(延长时间)、选择湿
转(半干转不适合大分子条带)、选择
NC膜，降低凝胶浓度
膜上无小分子条带
原因:膜孔径大于蛋白，转膜时间过长建议:减少转膜时间，选择PVDF膜
膜上无条带
原因:操作原因;膜的选择不适合
蛋白与膜的结合能力弱
建议:检查转膜条件、选取合适的膜
蛋白条带转到滤纸上
原因:电压过高;时间过长;膜的孔径太大
建议:降低电压，减少转膜时间，选择合适的膜
同一位置出现多条带
为什么同一位置出现多条带?
原因-1:目标蛋白具有多种修饰形式
·磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等不同修饰作用在同一关键通路枢纽靶标上
原因-2:蛋白表位相似但结构不同
·新检测出文献未报到蛋白或同一家族蛋构型不同，或是细胞株纯度不够
原因-3:细胞传代过多，蛋白表达异常
·多次传代发生基因组素乱，二倍体消失或其他编码表达异常的现象
处理方法-1
，结果正常
处理方法-2
√ 接受该结果作为分析讨论的对象
处理方法-3
√ 更换细胞株或重新分离原代细胞
原因-4:目标蛋白有多聚体
非单体结构的蛋白，在SDS-PAGE前的沸煮时间不足，导致蛋白解聚不充分
处理方法-4
√ 充分做好课题调研，了解目标蛋白特性和结构
优化样品处理方式
