赫尔曼陆龟（Testudo Hermanni）是常见且受欢迎的宠物。他们的预期寿命超过80岁。这些陆龟面临的主要威胁包括自然栖息地的丧失、污染、城市化、旅游业、道路死亡、宠物贸易以及各种传染病的可能传播。健康问题可能在人工孵化期间开始并持续一生。为此，需要培育出健康的幼龟，陆龟的福利也会同步提高。必须控制孵化条件和控制蛋失败。尽可能减少未受精和受感染卵的数量对于成功孵化非常重要。这些参数可以通过监测育种亲本来改善。适当的孵化可以让许多陆龟存活下来，让它们健康长寿，这对于陆龟福利至关重要，可以提供更经济的繁殖方法。在这项研究中，确定了斯洛文尼亚大型农场人工孵化期间赫曼陆龟（Testudo Hermanni ）胚胎死亡的原因。描述了赫尔曼陆龟孵化的可能改进以及提高动物福利的方法。

确定了赫尔曼陆龟（ Testudo Hermanni ）在人工孵化过程中胚胎死亡的原因。研究了孵化期结束时蛋的完全失败情况。孵化制品占所有蛋 (N = 18,520) 的 19.2% (N = 3557)。孵化蛋成活率为80.8%。根据孵化失败的原因对卵（即胚胎）进行分类并随后进行分析。一些鸡蛋被分成两组或更多组。未受精蛋占 61.0%，感染蛋占 52.5%，处于不同干燥阶段的蛋占 19.1%。该组还包括木乃伊胚胎。在受感染的鸡蛋中经常发现铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、淡紫紫菌和大肠杆菌。胚胎被分为三组：所有未孵化胚胎中长达 1.0 厘米的胚胎 — 第 1 组 (2.2%)、1.0 厘米至 1.5 厘米的胚胎 — 第 2 组 (5.4%) 和长度超过 1.5 厘米的胚胎 — 第 3 组 (7.3%)蛋。1.3% 的胚胎无法啄壳。这些乌龟在孵化前不久就死了。0.7% 的病例确认第 2 组和第 3 组的胚胎仍然存活。第 3 组中分别有 0.5% 和 0.1% 的病例检测到死亡和存活的畸形胚胎和双胞胎。为了成功进行人工孵化，重要的是在孵化前用消毒剂进行熏蒸，并消除不同形状的蛋、破壳蛋和重量在10克以下的蛋。人工孵化前和人工孵化过程中应定期对鸡蛋进行烛光检查，并清除所有未受精和死亡的胚胎。建议使用心率监测器。适当的温度和湿度、在无菌基质上孵化“干净”的蛋以及控制螨虫的存在至关重要。对陆龟父母的监测也是必要的。

一.简介
赫尔曼陆龟是一种中型陆地物种，天然存在于欧洲地中海。目前区分出两个亚种：西欧的Testudo hermanni hermanni和东欧的Testudo hermanni boettgeri ( T. h. boettgeri )。鸡蛋是白色的，硬壳，形状几乎是椭圆形的。赫尔曼睾龟每窝最多产七枚蛋，T. h. Boettgeri最多产九颗蛋 [ 1 ]。
海龟的蛋黄含量为 32% 至 55%，蜥蜴和蛇的蛋黄含量为 72% 至 99%。爬行动物蛋不包含将蛋黄固定在中心位置的系带。发育中的胚胎漂浮在蛋黄表面。如果卵子运动或旋转不正确，胚胎血管可能会破裂，从而导致胚胎死亡[ 2 ]。与鸟蛋相反，通常认为爬行动物蛋如果在产蛋初期或产蛋后滚动或翻转，反应不佳[ 3 ]。Stvarnik等人，2017年[ 4 ]发现了T. h.的卵。Boettgeri由 12.5% 的壳、46.9% 的蛋白和 40.6% 的蛋黄组成。蛋白的折射率为1.3341，蛋黄的折射率为1.5120。蛋白含有 98.2% 的水、0.9% 的蛋白质、0.7% 的灰分和微量的脂肪。蛋黄含水60.6%，蛋白质21.0%，脂肪14.2%，灰分4.0%。
赫尔曼陆龟的活跃期为三月至十月底，筑巢活动在三月至四月和八月至九月期间达到高峰[ 5 ]。性活跃的雄性腹甲最小尺寸约为 120 毫米，雌性腹甲最小尺寸约为 130 毫米。陆龟的交配习惯很杂乱，并且没有证据表明择偶与体型有关。在自然界中，筑巢地点的选择与地面温度相关，筑巢本身主要发生在傍晚前，此时地面温度特征最能反映给定地点的相对温度[ 6 ]。
野生条件下潜伏期为 90-124 天，在 22-35 °C 人工条件下潜伏期为 56-102 天 [ 5 ]。在表现出环境决定性别的龟类中，雌性是由在高于 29 °C 的温度下孵化的卵产生的，而雄性是由在较低温度下孵化的卵产生的 [ 7 ]。温度依赖性性别决定是赫曼睾龟的特征。T. h.的性别比例为 50% 。Boettgeri 的阈值温度为 31.5 °C [ 8 ]。
关于海龟胚胎发育的文献数据很少。没有关于睾丸属胚胎发育的数据。胚胎发育已在一些软壳龟（Pelodiscus sinensis、Apalone spinifera）[ 9 , 10 ]、海龟（Lepidochelys olivacea、Dermochelys sp .）[ 11 , 12 ]、Emydid 龟（Trachemys scripta）[ 13 ]中得到描述。 ，以及蛇纹龟[ 14 ]。文献中提到了爬行动物的畸形胚胎[ 15 , 16 ]。海龟、鳄鱼、蜥蜴和蛇的双胞胎很少见，但有报道称，双胞胎发育为大小相等或不等的独立个体，以及不同程度的畸形，称为轴分叉[ 17 ]。
生殖成功可能受到内在和外在因素的影响。母亲的影响已被证明是后代生存和健康变异的重要内在来源。雌性可以通过筑巢地点的选择来影响繁殖性能。与巢穴微生境相关的外在因素，如孵化温度和基质水势，会影响陆龟的孵化和孵化幼龟的成活率[ 18 ]。孵化可能需要几个小时甚至几天[ 19 ]。
我们坚信，高孵化质量对于陆龟的进一步发展和福利以及更经济的繁殖方式至关重要。因此，我们的目的是确定T. h.胚胎死亡的原因。斯洛文尼亚一个大型农场的人工孵化过程中的boettgeri 。这项研究的目的是可能改善赫尔曼陆龟的孵化并提高饲养的福利水平。

二.检测
这项研究是在一个海龟养殖场进行的，该养殖场饲养了多种物种，主要是赫尔曼陆龟亚种T. h. 博特杰里。这些陆龟可以在户外和温室里自由漫步，但幼龟除外，幼龟被饲养在室内玻璃容器中。它们在最初的三年里都生活在室内，以保护它们免受掠食者的侵害。5月至7月的产蛋期结束后，人工孵化还要持续两个月。到8月底，孵化完成，对孵化场废弃物总量进行了检查，共3557枚蛋，以确定死亡原因。
孵化制品占所有蛋的 19.2% (N = 18,520)。孵化蛋成活率为80.8%。农场收获的所有鸡蛋均在相同条件下处理、运输和人工孵化。从标有旗帜的巢中取出的鸡蛋被小心地挖出来，并立即运入预孵化室。不到六个小时，鸡蛋就被放入孵化器中。孵化时的温度在 31°C 至 32°C 之间变化。保持湿度，使卵产在偶尔湿润的基质（无菌蛭石）上。平均湿度为80.0%，孵化时间为63天。在放入鸡蛋之前，用 F10 SC（防腐溶液，以 1:250 浓度预稀释，健康与卫生，拉夫堡，英国）对孵化器进行熏蒸。
孵化期间使用烛光检查和听诊胚胎心率并测量脉冲频率（Egg Buddy MK1 用于鸟类和爬行动物的数字蛋心监视器，Avitronics，特鲁罗，英国）。
孵化期结束后，对所有未孵化的蛋进行分析。根据受精和胚胎死亡原因对卵子进行分组。根据大小不同将胚胎分为三组。第 1 组的陆龟最大长度为 1.0 厘米，第 2 组包括尺寸从 1.0 厘米到最大 1.5 厘米的陆龟，第 3 组包括长度超过 1.5 厘米的陆龟。在最后一组中，还观察到无法啄壳和不同大小的卵黄袋。测定未受精卵、干燥和受感染卵以及胚胎的百分比。涉及双胞胎的畸形胚胎也被包括在内。在胚胎发育初期，未受精卵和受精卵之间的差异明显为白点，几天后，观察到受精卵中存在血管。从未孵化的受感染卵和胚胎中取出拭子并进行分析。进行了一般细菌学和真菌检查[ 20 ]。体外寄生虫被送去进一步测定。

三.结果
百分比始终根据死卵总数计算 (N = 3557)。
我们检测到未受精的鸡蛋占 61.0%，受感染的鸡蛋（细菌和真菌感染）占 52.5%，干燥的鸡蛋占 19.1%，其中一些还被木乃伊化 (0.42%)。检测到死活畸形胚胎（0.48%）和双胞胎（0.11%）。最常见的是甲壳畸形和尾巴缺失、色素脱失、脐疝、体腔开放、眼睛或独眼巨人缺失以及连体双胞胎（副下颌、头侧、胸侧和脐侧）。许多蛋折叠成两组或更多组（例如，同时发霉和木乃伊化）。在我们的研究中，0.73%的鸡蛋同时未受精、干燥和发霉。在 24.1% 中，我们无法确认受精，因为变化太大，只有 14.9% 中受精明显。其主要原因是不同病原体的感染。受感染的鸡蛋中最常见的是铜绿假单胞菌、芽孢杆菌、淡紫紫菌和大肠杆菌。在某些情况下，细菌和真菌仍未确定。2.7%的鸡蛋被螨虫侵染。
胚胎长达 1.0 厘米（第 1 组）的比例为 2.2%，胚胎长度为 1.0 厘米至 1.5 厘米（第 2 组）的比例为 5.4%，胚胎长度超过 1.5 厘米（第 3 组）的比例为 7.3%。在这组胚胎中，一些胚胎在孵化前不久就死亡了，因为它们无法啄壳（1.3%）。第 2 组和第 3 组的胚胎仍存活的确认率为 0.7%。在这两组中，有 3/4 的胚胎属于第 3 组。

四.讨论
赫尔曼陆龟在这个季节通常有两个巢。第三个巢穴在一些T. h. 文献中很少被描述。boettgeri个体 [ 21 , 22 ]。T.h. Boettgeri雌性平均每个巢产 4.3 个蛋，最多 9 个蛋 [ 22 ]。在我们的气候环境中（朱利安阿尔卑斯山的最南端），第一个交配季节通常在五月开始，第二个交配季节在八月（图1a、b）。农场产蛋的主要筑巢季节是五月和六月，没有性活动。雌性第一窝产 1-7 个蛋（平均 3.6 个蛋），第二窝产 1-6 个蛋（平均 3.1 个蛋）（图2a、b）。Stvarnik, 2020 [ 19 ] 证实了陆龟体重和每窝产蛋数量之间具有统计学显着相关性，但陆龟体重和平均产蛋重量之间没有建立显着相关性。
图一
交配季节。( a )赫曼陆龟的交配季节通常从四月持续到七月中旬，具体取决于气候条件。( b ) 饲养员用旗子标记巢穴，以便更容易收集鸡蛋。

图二
挖掘、布置巢穴、产卵。( a )（左栏）雌性在土壤中挖的洞中产卵。每个蛋都用爪子在巢中的确切位置对齐。这只雌性产下了三个蛋。( b )（右栏）这只雌性产下了五个蛋，并在产下最后一个蛋后用土壤覆盖它们。对于单个鸡蛋来说，对齐可能需要几分钟的时间。

陆龟体重和每窝蛋数量之间的差异可能与饮食和健康状况相关。T.h. Bertolero 等人测量了boettgeri卵的大小。（2011）尺寸为27.9×37.4毫米，鸡蛋重17.1克。T. h.的平均大小。Stvarnik等人2017年测量的boettgeri卵[ 20 ]为29.9×39.5 mm，平均重量为20.7 g。贝尔托莱罗等人。[ 22 ] 确定的平均值略低于 Stvarnik 等人。T.h. Highfield (1996) 测量的boettgeri卵较大，为 40 × 29 mm，但重量较轻 (12–14 g) [ 23 ]。Hailey 和 Loumbourdis (1988) 发现T. h.的平均卵重。Boettgeri 的重量为 17.8 g，范围为 10.5 g 至 23.5 g [ 24 ]。在我们 2020 年的研究中， T. h.的平均大小。Boettgeri鸡蛋的数量少于 2017 年的测量结果 [ 4 ]。平均测量结果：宽度和长度为 27.9 × 35.6 毫米，平均重量为 16.5 克（图3a）。

龟蛋收藏。( a ) 在研究中，鸡蛋在放入培养箱之前用游标卡尺进行测量。使用无菌手套。( b ) 直接从乌龟挖的洞中收集乌龟蛋。贝壳表面还残留着整个孵化过程中残留的土壤。用于研究目的的鸡蛋被标记为可追溯性。
在收集期间和整个孵化过程中，蛋必须保持在收集时的相同位置。家禽蛋和龟蛋的采集存在较大差异。产卵后几个小时内，爬行动物胚胎上升到卵的顶部并开始粘附在壳的内膜上。如果在胚胎附着后翻转鸡蛋，蛋黄的重量可能会阻碍正常发育或撕裂卵黄膜和胚胎外膜，导致死亡或畸形[ 3 ]。爬行动物卵在发育过程中对其水平轴运动敏感的原因之一是缺乏系带[ 2 ]。Aubert等人，2015年[ 3 ]发现，与未翻身的胚胎相比，蛇的出生后死亡率明显更高。他们建议不要将鸡蛋从其自然位置移开。龟蛋收集是成功孵化的非常重要的一部分（图3b). 六个小时内，鸡蛋被放入消毒的孵化器中。熏蒸消毒液使用F10 SC（图4）。
图四

将乌龟蛋放入孵化器中。总共有 18,520 个Testudo Hermanni boettgeri产下的卵被放入孵化器中。孵化蛋成活率为80.8%。
图五

在孵化过程中，可以用烛光检查鸡蛋[ 25,26 ]（图5A）。新鲜鸡蛋的蛋白是混浊的并且很厚（图5b). 随着鸡蛋的老化，当空气通过蛋壳的孔隙时，蛋白变得几乎透明且稀薄（图5C）。每个蛋黄都覆盖着一层薄薄的透明膜，可以防止蛋黄破裂。随着鸡蛋的老化，这种膜会变得越来越薄，因此新鲜的蛋黄会站得更高并且不太可能破裂。随着鸡蛋的老化，蛋黄会吸收蛋白中的水分。评估 T. h. 的基本组成、氨基酸和脂肪酸谱以及某些微量元素的存在。Stvarnik 等人已经提到过boettgeri鸡蛋。[ 4 ]。
人工孵化过程中对鸡蛋的检查——未受精的鸡蛋。( a )在这种情况下，观察到未受精卵。当光线透过鸡蛋时，可以看到相当大的空白空间。看来胚胎发育还没有开始。( b )我们把这个鸡蛋打碎后，结果是一样的。我们还看到系带不存在。这颗蛋在我们检查前已经孵化了几周，而且不新鲜。在此图像中观察到蛋白和蛋黄的结构。( c ) 在该图中，有一个孵化一小时后的新鲜蛋。结构与非新鲜鸡蛋不同图5b.

用烛光照射鸡蛋来评估是否存在胚胎发育。干燥的鸡蛋也通过烛光检查得到证实（图6a-e）。
图六.

见图六.
人工孵化过程中对鸡蛋的检查——干燥的鸡蛋。( a ) 在烛光灯下观察到该蛋有干燥现象。( b )我们把这个鸡蛋打碎后，发现了未受精蛋的正在干燥的蛋黄。( c )在发育后期，可以观察到胚胎的运动。在该图中，阴影是死亡的胚胎，并且在胚胎下方可以看到蛋黄。血管化网格不可见。( d ) 鸡蛋被打破后，可以看到一个死亡、干燥的胚胎。观察到血管化。( e )另一个未受精的鸡蛋，干燥过程开始于此。

发育蛋监测器（ Egg Buddy MK1 Digital Egg Heart Monitor for Birds and Reptiles, Avitronics, Truro, UK）被许多饲养者用来识别爬行动物和鸟类蛋中的胚胎活力 [ 26 , 27 ]，也建议用于40克以下的小型脊椎动物[ 28 ]。在这项研究之前，农场并未定期使用心脏监测（图7）。然而，心跳检查可能有助于确定胚胎死亡。
卵子的活力可以通过烛光检查或听诊胚胎心脏来确定。
图七.