NEJM：开天辟地！全球首个人体内CRISPR/Cas9基因编辑临床研究数据发布，患者病情缓解丨临床大发现
07-14 02:26
CRISPR/Cas9基因编辑技术自2012年问世起，便受到全世界分子生物学家、医学家们的广泛关注。
简单的说，通过向靶细胞递送一个包含向导RNA（gRNA）及Cas9核酸内切酶的复合体，科学家们可以实现在基因组的特定位置敲除或添加目标DNA序列的目的[1]。这一高精度、高效、低成本基因编辑技术的发现者Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna也因此获得了2020年诺贝尔化学奖。
在过去的近十年中，科学家们利用CRISPR/Cas9技术在细胞、小鼠、非人灵长类动物（猴子）中，进行了大量基因编辑实验。但这一技术能否安全地应用于人体，能否通过重新编辑纠正致病基因，治疗遗传性疾病，是一直困扰生物医学家们的重要问题。
近日，由伦敦大学学院的Julian D. Gillmore领衔的研究团队在《新英格兰医学杂志》在线发表了全球第一项CRISPR/Cas9临床试验的阶段性研究结果[2]。
他们的研究发现，通过静脉输注脂质体包裹的CRISPR/Cas9复合体，可有效降低转甲状腺素蛋白淀粉样变患者外周血中致病蛋白水平，从而缓解病情进展。《自然》杂志发表述评称，这是基因治疗领域一项里程碑式的研究，可能开启了治疗罕见遗传病的新纪元[3]。
论文首页截图
转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR）是大量错误折叠的TTR蛋白形成淀粉样纤维聚集在心脏、神经等组织，所致的进展性、致死性疾病[4]。
ATTR既可以是获得性的（被称为野生型ATTR），也可能是TTR基因突变导致的常染色体显性遗传病（hATTR）。
目前，已经发现的TTR突变位点有超过100种，影响着全世界5万多患者的生命健康[5]。
ATTR的病理生理机制[6]
目前针对ATTR的治疗方案主要有两种思路：稳定TTR蛋白四聚体结构（如， diflunisal、tafamidis）；或利用RNA干扰技术降解TTR mRNA，从而抑制其蛋白合成（如，inotersen，patisiran等基因治疗产品）[7,8]。这些产品都可以有效减轻ATTR相关症状并促进功能恢复，但需要长期服药以达到将TTR维持在较低水平的目的。
遗憾的是，有报道称接受稳定TTR类药物治疗的hATTR患者仍会出现疾病不断进展的情况[9]；而RNA干扰类药物inotersen有导致肾小球肾炎、血小板减低等副作用的风险[10]。
因此，利用CRISPR/Cas9技术持续、稳定地敲减TTR基因，可能是治疗hATTR这一单基因遗传病更好的选择。
实际上，hATTR具有很多适用于CRISPR/Cas9基因治疗的特性。
比如，TTR基因功能相对局限，主要负责甲状腺素与维生素A的转运。这就意味着，敲除TTR基因所导致的副作用相对有限。
再比如，循环中几乎所有的TTR蛋白（>99%）均由肝脏合成；而研究者团队前期建立了完善的向肝脏递送药物的纳米材料体系，使得利用CRISPR/Cas9治疗hATTR具有很好的靶向性以及较低的系统毒性。
据此，Intellia公司研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为NTLA-2001。该产品包括，具有亲肝性的纳米脂质体（LNP），及其包裹的靶向TTR基因的单链向导RNA和编码Cas9的mRNA（如下图所示）。
NTLA-2001治疗hATTR示意图
治疗采取静脉输注的方式。NTLA-2001进入循环后，LNP会结合载脂蛋白（ApoE），进而被肝细胞通过表面低密度脂蛋白受体（LPL-R）主动内吞到胞内形成内体。
内体膜及LNP降解后，释放Cas9 mRNA在核糖体翻译出Cas9核酸内切酶，与sgRNA形成核糖蛋白复合体进入细胞核。这一复合体可特异性识别TTR基因中原间隔序列（PAM 序列），并介导DNA切割。
随后肝细胞将通过非同源重组的方式对剪切后的TTR基因进行修正，而这一过程中产生的插入缺失或移码突变将最终抑制TTR蛋白翻译，从而敲减致病蛋白TTR（如下图所示）。
NTLA-2001细胞内作用示意图
那么，NTLA-2001基因治疗hATTR的安全性及有效性究竟如何呢？研究者首先在原代肝细胞中进行了测试，发现当sgRNA浓度在0.05-0.15nmol/L范围内时，即可使TTR mRNA水平降低91%以上， TTR蛋白水平降低95%以上。
而在脱靶效应检测方面，研究者测序检测了来自Cas-OFFinder、GUIDE-seq、SITE-seq等多个数据库预测的7个可能脱靶位点，均未检测到脱靶基因编辑。
原代肝细胞中检测NTLA-2001对TTR基因的编辑效率
研究人员随后在TTR转基因小鼠中检验了NTLA-2001的治疗效果，他们发现NTLA-2001可有效降低血浆TTR蛋白水平。这一治疗作用于4周后达到最佳水平，并可维持12个月[11]。
在非人灵长类动物食蟹猴中，研究者摸索出3.0-6.0mg/kg的剂量可以达到最佳的TTR基因编辑效率，即实现全肝基因编辑效率达73%，血液中TTR蛋白水平下降超过94%，疗效可维持12个月以上。
食蟹猴中检测NTLA-2001对TTR基因的编辑效率
为继续探究NTLA-2001治疗hATTR患者的情况，Intellia公司申请了单剂量NTLA-2001治疗合并有多发神经病变的hATTR患者的多中心临床试验（NCT04601051）。
参与本研究的6例患者分别来自新西兰奥克兰（2人）及英国伦敦（4人）。他们的年龄在46-64岁之间，体重在70-90kg之间，其中4位是男性，涉及3种不同的TTR基因突变类型（p.T80A 3人，p.S97Y 2人，p.H110D 1人）。
其中有3人既往未接受过任何相关治疗，另外3人接受过diflunisal治疗。所有患者心功能指标NYHA I级，N末端脑利尿肽水平在50-596ng/L范围内。
6名患者被分成两组，一组的总RNA剂量为0.1mg/kg，另一组的总RNA剂量为0.3mg/kg。所有患者在治疗前都使用糖皮质激素及抗组胺药，以减少静脉输注LNP引起的炎症反应。
治疗后有3名受试者出现了轻度的不良反应，但未见明显的不良事件。其中5位患者在治疗后4-24h内出现D-二聚体升高，但7天内全部降至正常基线水平。凝血指标方面，活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）均保持在参考值上限的1.2倍以内，纤维蛋白原、血小板计数均高于参考值范围下限。肝功能指标未见异常。
在治疗后28天，0.1mg/kg低剂量组hATTR患者TTR水平平均下降52%（47%-56%），而0.3mg/kg高剂量组患者TTR水平平均下降达87%（80%-96%）。这一剂量依赖表型与临床前试验结果一致。值得一提的是，在全部6名受试者中均观察到了治疗后TTR浓度下降。
NTLA-2001治疗hATTR患者疗效评价
尽管本研究存在着纳入受试者数目有限、观察时间有限等不足，但这一CRISPR/Cas9基因治疗hATTR患者安全性及有效性的阶段性研究结果，无疑是令人兴奋的。这预示着，罕见遗传病患者可能通过基因编辑技术，得以缓解甚至治愈。
Intellia公司主席John Lenonard称，他们目前能够实现向小鼠骨髓递送CRISPR/Cas9组分，并希望以此为基础治疗镰状细胞贫血。靶向不同脏器递送CRISPR/Cas9组分的技术正在不断更新，我们也热切期盼着这些新进展推进基因治疗更多遗传性疾病成为可能！
07-14 02:26
CRISPR/Cas9基因编辑技术自2012年问世起，便受到全世界分子生物学家、医学家们的广泛关注。
简单的说，通过向靶细胞递送一个包含向导RNA（gRNA）及Cas9核酸内切酶的复合体，科学家们可以实现在基因组的特定位置敲除或添加目标DNA序列的目的[1]。这一高精度、高效、低成本基因编辑技术的发现者Emmanuelle Charpentier和Jennifer Doudna也因此获得了2020年诺贝尔化学奖。
在过去的近十年中，科学家们利用CRISPR/Cas9技术在细胞、小鼠、非人灵长类动物（猴子）中，进行了大量基因编辑实验。但这一技术能否安全地应用于人体，能否通过重新编辑纠正致病基因，治疗遗传性疾病，是一直困扰生物医学家们的重要问题。
近日，由伦敦大学学院的Julian D. Gillmore领衔的研究团队在《新英格兰医学杂志》在线发表了全球第一项CRISPR/Cas9临床试验的阶段性研究结果[2]。
他们的研究发现，通过静脉输注脂质体包裹的CRISPR/Cas9复合体，可有效降低转甲状腺素蛋白淀粉样变患者外周血中致病蛋白水平，从而缓解病情进展。《自然》杂志发表述评称，这是基因治疗领域一项里程碑式的研究，可能开启了治疗罕见遗传病的新纪元[3]。
论文首页截图
转甲状腺素蛋白淀粉样变（ATTR）是大量错误折叠的TTR蛋白形成淀粉样纤维聚集在心脏、神经等组织，所致的进展性、致死性疾病[4]。
ATTR既可以是获得性的（被称为野生型ATTR），也可能是TTR基因突变导致的常染色体显性遗传病（hATTR）。
目前，已经发现的TTR突变位点有超过100种，影响着全世界5万多患者的生命健康[5]。
ATTR的病理生理机制[6]
目前针对ATTR的治疗方案主要有两种思路：稳定TTR蛋白四聚体结构（如， diflunisal、tafamidis）；或利用RNA干扰技术降解TTR mRNA，从而抑制其蛋白合成（如，inotersen，patisiran等基因治疗产品）[7,8]。这些产品都可以有效减轻ATTR相关症状并促进功能恢复，但需要长期服药以达到将TTR维持在较低水平的目的。
遗憾的是，有报道称接受稳定TTR类药物治疗的hATTR患者仍会出现疾病不断进展的情况[9]；而RNA干扰类药物inotersen有导致肾小球肾炎、血小板减低等副作用的风险[10]。
因此，利用CRISPR/Cas9技术持续、稳定地敲减TTR基因，可能是治疗hATTR这一单基因遗传病更好的选择。
实际上，hATTR具有很多适用于CRISPR/Cas9基因治疗的特性。
比如，TTR基因功能相对局限，主要负责甲状腺素与维生素A的转运。这就意味着，敲除TTR基因所导致的副作用相对有限。
再比如，循环中几乎所有的TTR蛋白（>99%）均由肝脏合成；而研究者团队前期建立了完善的向肝脏递送药物的纳米材料体系，使得利用CRISPR/Cas9治疗hATTR具有很好的靶向性以及较低的系统毒性。
据此，Intellia公司研发了基于CRISPR/Cas9技术的基因治疗产品，命名为NTLA-2001。该产品包括，具有亲肝性的纳米脂质体（LNP），及其包裹的靶向TTR基因的单链向导RNA和编码Cas9的mRNA（如下图所示）。
NTLA-2001治疗hATTR示意图
治疗采取静脉输注的方式。NTLA-2001进入循环后，LNP会结合载脂蛋白（ApoE），进而被肝细胞通过表面低密度脂蛋白受体（LPL-R）主动内吞到胞内形成内体。
内体膜及LNP降解后，释放Cas9 mRNA在核糖体翻译出Cas9核酸内切酶，与sgRNA形成核糖蛋白复合体进入细胞核。这一复合体可特异性识别TTR基因中原间隔序列（PAM 序列），并介导DNA切割。
随后肝细胞将通过非同源重组的方式对剪切后的TTR基因进行修正，而这一过程中产生的插入缺失或移码突变将最终抑制TTR蛋白翻译，从而敲减致病蛋白TTR（如下图所示）。
NTLA-2001细胞内作用示意图
那么，NTLA-2001基因治疗hATTR的安全性及有效性究竟如何呢？研究者首先在原代肝细胞中进行了测试，发现当sgRNA浓度在0.05-0.15nmol/L范围内时，即可使TTR mRNA水平降低91%以上， TTR蛋白水平降低95%以上。
而在脱靶效应检测方面，研究者测序检测了来自Cas-OFFinder、GUIDE-seq、SITE-seq等多个数据库预测的7个可能脱靶位点，均未检测到脱靶基因编辑。
原代肝细胞中检测NTLA-2001对TTR基因的编辑效率
研究人员随后在TTR转基因小鼠中检验了NTLA-2001的治疗效果，他们发现NTLA-2001可有效降低血浆TTR蛋白水平。这一治疗作用于4周后达到最佳水平，并可维持12个月[11]。
在非人灵长类动物食蟹猴中，研究者摸索出3.0-6.0mg/kg的剂量可以达到最佳的TTR基因编辑效率，即实现全肝基因编辑效率达73%，血液中TTR蛋白水平下降超过94%，疗效可维持12个月以上。
食蟹猴中检测NTLA-2001对TTR基因的编辑效率
为继续探究NTLA-2001治疗hATTR患者的情况，Intellia公司申请了单剂量NTLA-2001治疗合并有多发神经病变的hATTR患者的多中心临床试验（NCT04601051）。
参与本研究的6例患者分别来自新西兰奥克兰（2人）及英国伦敦（4人）。他们的年龄在46-64岁之间，体重在70-90kg之间，其中4位是男性，涉及3种不同的TTR基因突变类型（p.T80A 3人，p.S97Y 2人，p.H110D 1人）。
其中有3人既往未接受过任何相关治疗，另外3人接受过diflunisal治疗。所有患者心功能指标NYHA I级，N末端脑利尿肽水平在50-596ng/L范围内。
6名患者被分成两组，一组的总RNA剂量为0.1mg/kg，另一组的总RNA剂量为0.3mg/kg。所有患者在治疗前都使用糖皮质激素及抗组胺药，以减少静脉输注LNP引起的炎症反应。
治疗后有3名受试者出现了轻度的不良反应，但未见明显的不良事件。其中5位患者在治疗后4-24h内出现D-二聚体升高，但7天内全部降至正常基线水平。凝血指标方面，活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）均保持在参考值上限的1.2倍以内，纤维蛋白原、血小板计数均高于参考值范围下限。肝功能指标未见异常。
在治疗后28天，0.1mg/kg低剂量组hATTR患者TTR水平平均下降52%（47%-56%），而0.3mg/kg高剂量组患者TTR水平平均下降达87%（80%-96%）。这一剂量依赖表型与临床前试验结果一致。值得一提的是，在全部6名受试者中均观察到了治疗后TTR浓度下降。
NTLA-2001治疗hATTR患者疗效评价
尽管本研究存在着纳入受试者数目有限、观察时间有限等不足，但这一CRISPR/Cas9基因治疗hATTR患者安全性及有效性的阶段性研究结果，无疑是令人兴奋的。这预示着，罕见遗传病患者可能通过基因编辑技术，得以缓解甚至治愈。
Intellia公司主席John Lenonard称，他们目前能够实现向小鼠骨髓递送CRISPR/Cas9组分，并希望以此为基础治疗镰状细胞贫血。靶向不同脏器递送CRISPR/Cas9组分的技术正在不断更新，我们也热切期盼着这些新进展推进基因治疗更多遗传性疾病成为可能！
