摘 要
堇菜属 (Viola) 植物多数为多年生，少数为二年生草本。中国堇菜属野生资源丰富，
约有 110 种，很多具有三色堇栽培种少有的叶片奇特、耐热耐寒性强等优点。远缘杂交
是培育新品种的重要途径，探讨堇菜属植物远缘杂交的亲和性，对于培育综合性状优良
的堇菜属新种质具有重要意义。本研究以 12 个堇菜属种质为材料，对其核型进行了分
析，研究了生殖生物学特性，在此基础上，优选相关的组合进行杂交，采用苯胺蓝染色
荧光观察法、石蜡切片法观察分析了堇菜属杂交后授粉受精及胚胎发育情况，并对其杂
交后代进行了鉴定，主要结论如下：
6 个野生堇菜核型分析结果如下：西山堇菜核型公式为 2n=2x=24=10m+14sm，斑叶
堇菜核型公式为 2n=2x=24=14m+10sm，裂叶堇菜核型公式为 2n=2x=24=20m+2st+2
sm，鸡腿堇菜核型公式为 2n=2x=20=8sm+12m，早开堇菜核型公式为 2n=4x=48=36sm+
12m，紫花地丁的核型公式为 2n=4x=48=36sm+12m。核型不对称系数范围为：60.99
%~65.57 %。根据最长与最短染色体长度比值和臂比大于 2 的染色体比例两项特征，西
山堇菜、斑叶堇菜、裂叶堇菜、鸡腿堇菜、早开堇菜的核型分类均为 2A 型，紫花地丁
属于 3A 核型。6 个野生堇菜种质的进化程度高低为：紫花地丁＞早开堇菜＞西山堇菜
＞斑叶堇菜＞鸡腿堇菜＞裂叶堇菜。
6 个野生堇菜、3 个角堇、3 个大花三色堇种质开花时柱头均高于花药，柱头可授性
和散粉时间有重叠。花粉/胚珠比、杂交指数以及授粉试验结果表明：早开堇菜、紫花地
丁繁育系统为自交亲和的兼交系统，有时需要传粉者；其余 10 个种质的繁育系统均为
兼性异交，部分自交亲和，需要传粉者。
通过扫描电镜观察了 12 个堇菜属种质花粉表观形态，结果表明：6 个野生堇菜花粉
粒整体观为长椭球形或椭球型，花粉赤道面观长椭圆形，两端渐窄，极面观三裂圆形或
近圆形，花粉表面较为光滑，有穿孔；角堇和大花三色堇花粉粒表观形状为矩形或五角
柱形，花粉赤道面观长方形或五菱形，极面观四裂正方形或五角柱形，花粉具 4-5 孔沟，
萌发沟以等间距环状分布，外壁纹饰为皱波状纹饰。
早开堇菜花粉萌发适宜的培养基为：蔗糖 280 g/L+硼酸 240 mg/L+GA390mg/L+Ca(NO3)2200 mg/L；大花三色堇花粉萌发适宜的培养基为：240 g/L 蔗糖+260mg/L 硼酸+ GA390 mg/L + Ca(NO3)2200 mg/L。适宜斑叶堇菜、裂叶花粉萌发的培养基为：285 g/L-1蔗糖+250 mg/L-1硼酸+50 mg/L-1GA3+200 mg/L-1Ca(NO3)2。不同贮藏温
度对花粉生活力的影响差异较大，－80 ℃贮藏效果最佳。3 种保护酶活性对裂叶堇菜、
斑叶堇菜花粉萌发率的影响依次为：SOD>CAT> POD。
苯胺蓝法观察花柱及石蜡切片观察子房结果表明：授粉后，花粉萌发少、花粉管在
花柱花粉管通道内不能顺利生长是 JB-1-1-2×西山堇菜、EYO-1-2-1-5×西山堇菜、
EYO-1-2-1-5×早开堇菜杂交不育的根本原因。石蜡切片观察子房结果表明：胚乳退化解
体、胚囊中空、胚胎发育缺乏营养供给是 EYO-1-2-1-5×早开堇菜、JB-1-1-2×斑叶堇菜、
DFM-16-2-2×裂叶堇菜、E01×早开堇菜、PXP-BT-D-1-1-4×早开堇菜、EYO-1-2-1-5×西
山堇菜、JB-1-1-2×西山堇菜杂交不育的根本原因。
通过对 10 个杂交后代表型性状鉴定，发现杂交后代偏母性遗传较多，初步判断早
开 堇 菜 × E01、 早 开 堇 菜 × PXP-BT-1-1-4、 西 山 堇 菜 × 08H、 西 山 堇 菜 ×
PXP-BT-D-1-1-4、西山堇菜×JB-1-1-2、斑叶堇菜×JB-1-1-2 为真正的远缘**，但还
需借助分子标记等手段来进一步确定。
关键词：堇菜属种质，核型分析，生殖生物学，花粉生活力，远缘杂交，亲和性，**
鉴定

目 录
摘 要...........................................................................................................................................I
ABSTRACT ...............................................................................................................................III
第一章 文献综述.......................................................................................................................1
1.1 植物染色体核型分析...................................................................................................1
1.2 堇菜属生殖生物学研究...............................................................................................1
1.2.1 开花物候学.........................................................................................................1
1.2.2 繁育系统研究.....................................................................................................1
1.3 植物花粉的生活力检测...............................................................................................2
1.4 远缘杂交研究进展.......................................................................................................3
1.4.1 植物远缘杂交受精前障碍.................................................................................3
1.4.2 植物远缘杂交受精后障碍.................................................................................4
1.4.3 杂交后代鉴定.....................................................................................................5
1.5 本研究的目的意义.......................................................................................................7
第二章 6 个野生堇菜种质核型分析........................................................................................9
2.1 材料与方法...................................................................................................................9
2.1.1 材料.....................................................................................................................9
2.1.2 染色体制片.........................................................................................................9
2.1.3 核型分析.............................................................................................................9
2.1.4 数据分析.............................................................................................................9
2.2 结果与分析.................................................................................................................11
2.2.1 6 个野生堇菜种质核型分析.............................................................................11
2.2.2 6 个野生堇菜种质的核型进化趋势分析.........................................................16
2.3 小结与讨论.................................................................................................................16
2.3.1 小结...................................................................................................................16
2.3.2 讨论...................................................................................................................17
第三章 12 个堇菜属种质生殖生物学研究............................................................................19
3.1 材料与方法.................................................................................................................19
3.1.1 材料...................................................................................................................19
3.1.2 数量性状调查...................................................................................................20
3.1.3 堇菜属种质花部特征及开花动态观测...........................................................21
3.1.4 堇菜属种质柱头可授性检测...........................................................................21
3.1.5 堇菜属种质花粉/胚珠比（P/O）调查测定 ...................................................21
3.1.6 堇菜属种质的杂交指数（OCI）的估算........................................................22
3.1.7 人工授粉实验...................................................................................................22
3.1.8 数据统计与分析...............................................................................................22
3.2 结果与分析.................................................................................................................22
3.2.1 12 个堇菜属种质遗传差异...............................................................................22
3.2.2 堇菜属种质花部特征.......................................................................................24
3.2.3 堇菜属种质柱头可授性...................................................................................27
3.2.4 堇菜属种质花粉／胚珠比（P/O） ................................................................28
3.2.5 堇菜属植物的杂交指数（OCI）估算............................................................29
3.2.6 不同授粉方法对 6 个堇菜属种质结实率的影响...........................................30
3.3 小结与讨论.................................................................................................................32
3.3.1 小结...................................................................................................................32
3.3.2 讨论...................................................................................................................32
第四章 部分堇菜属种质花粉生活力测定及贮藏期间酶活性变化.....................................35
4.1 材料与方法.................................................................................................................35
4.1.1 材料的采集与处理...........................................................................................35
4.1.2 堇菜属种质花粉扫描电镜观察.......................................................................35
4.1.3 不同蔗糖、硼酸对早开堇菜、大花三色堇花粉萌发的影响.......................35
4.1.4 不同 GA
3、Ca(NO3)2处理对早开堇菜、大花三色堇粉萌发的影响..........36
4.1.5 不同培养基对裂叶堇菜、斑叶堇菜花粉萌发的影响...................................36
4.1.6 12 个堇菜属种质花粉生活力测定...................................................................36
4.1.7 不同贮藏方法对裂叶堇菜、斑叶堇菜花粉萌发及保护酶活性的影响.......36
4.2 结果与分析.................................................................................................................37
4.2.1 12 个堇菜属种质花粉表观形态.......................................................................37
4.2.2 不同培养基对早开堇菜、大花三色堇花粉萌发的影响...............................38
4.2.3 不同培养基对裂叶堇菜、斑叶堇菜花粉萌发的影响...................................42
4.2.4 12 个堇菜属种质花粉生活力...........................................................................44
4.2.5 不同贮藏温度、贮藏时间下裂叶堇菜、斑叶堇菜花粉萌发情况...............45
4.2.6 不同贮藏温度与时间对裂叶堇菜、斑叶堇菜花粉保护酶活性的影响.......46
4.3 小结与讨论.................................................................................................................50
4.3.1 小结...................................................................................................................50
4.3.2 讨论...................................................................................................................51

第五章 12 个堇菜属种质正反交的育性研究........................................................................55
5.1 材料与方法.................................................................................................................55
5.1.1 材料...................................................................................................................55
5.1.2 授粉及果实的采集...........................................................................................55
5.1.3 花粉在柱头上萌发及花粉管伸长观察...........................................................55
5.1.4 石蜡切片法观察胚胎发育情况.......................................................................56
5.2 结果与分析.................................................................................................................56
5.2.1 杂交果实发育情况...........................................................................................56
5.2.2 花粉在柱头上萌发及花粉管伸长观察...........................................................58
5.2.3 不同发育时期子房石蜡切片...........................................................................62
5.2.4 **胚胎发育过程...........................................................................................63
5.3 小结与讨论.................................................................................................................66
5.3.1 小结...................................................................................................................66
5.3.2 讨论...................................................................................................................66
第六章 堇菜属杂交后代鉴定.................................................................................................69
6.1 材料与方法.................................................................................................................69
6.1.1 材料...................................................................................................................69
6.1.2 堇菜属杂交后代发芽试验...............................................................................69
6.1.3 堇菜属杂交后代形态学鉴定...........................................................................69
6.2 结果与分析.................................................................................................................70
6.2.1 堇菜属不同杂交组合发芽率比较...................................................................70
6.2.2 形态鉴定...........................................................................................................71
6.3 小结与讨论.................................................................................................................74
6.3.1 小结...................................................................................................................74
6.3.2 讨论...................................................................................................................74
第七章 总结与展望.................................................................................................................75
7.1 总结.............................................................................................................................75
7.2 展望.............................................................................................................................76
参考文献...................................................................................................................................77
致 谢.........................................................................................................................................85
攻读学位期间发表的学术论文...............................................................................................87

论文

第一章 文献综述
1.1 植物染色体核型分析
染色体核型分析是以有丝分裂中期的染色体为研究对象，对植物染色体的数目、长
度、形态、带型以及着丝粒位置等方面的分析研究
[1]，确定植物染色体的整体特征。染
色体核型分析是研究植物学分类、物种起源、进化及染色体结构、形态和功能之间关系
的重要手段，可以对育种中亲本的倍性、育性、亲缘关系等进行准确鉴定，为植物遗传
育种提供理论和实践依据。
核型分析已在榆叶梅
[2]、风毛菊
[3]、鸢尾
[4]、百合
[5]等园艺作物中成功应用，为其亲缘关系，遗传变异、系统演化研究以及展开杂交育种工作等提供了准确的细胞学依据
[6]。堇菜属植物种类众多，分布广和变异较大，其分类地位未见系统报导。关于堇菜属植物
核型方面，课题组王梦叶
[7]对大花三色堇、角堇核型进行了分析，发现大花三色堇均为
四倍体，染色体数目 2n=44~48，角堇为二倍体，染色体数目为 2n=26；魏长礼
[8]对 20种野生堇菜染色体数目进行分析，关于野生堇菜的核型分析尚未见报道，对野生堇菜的
核型进行分析，确定其核型类型，对于堇菜属远缘杂交、资源创新具有重要意义。
1.2 堇菜属生殖生物学研究
1.2.1 开花物候学
开花物候是植物繁育过程中必不可少的一部分，通常作用于传粉、种子扩散，开花
过程又分为花蕾期、始开花期、开花盛期、开花末期等，开放特征、单花花期、群体花
期、花朵数量、环境影响是繁育生物学的热点，植物开花受多种因素的影响，明确堇菜
属开花特性对后期育种、培育新品种具有重要意义。
1.2.2 繁育系统研究
堇菜属植物生殖特性的研究是提高堇菜属植物育种效率的基础。关于生殖生物学的
研究(如开花生物学、育种系统、授粉)已被广泛认为是确定植物繁殖成功和种群维持的
重要途径，特别是稀有或濒危物种。在自然种群中对于保障遗传多样性，从而有助于维持生物多样性尤其重要
[9]。繁育系统研究主要包括开花表现、花开放形式、花内器官发
育、交配系统等。人工杂交是研究繁育系统的最基本的方法。从传粉角度来看，花的生
物学特征与其传粉机制相适应：有效的传粉是以大量的花粉、有效的传粉媒介与处于可
授期的柱头为前提
[10-11]
。花粉必须在其活力最旺盛时到达柱头才能完成授粉过程，具有
接受花粉的适宜柱头的花朵即为柱头可授期。花粉保持活力的时间长短与柱头可授粉期
的时间长短结合在一起，深刻影响着植物的自花传粉率与授粉成功率等
[12-15]
，特别是异
花传粉的植物，但异交需要特定的条件才能完成其生殖过程，比如：优良的环境条件、
适宜的传粉媒介等。大量研究证实：自然界大部分植物都为自交、异交兼有的繁育系统
[16-17]
。有关研究表明：不同物种交配系统是适应性的、可变的和复杂的过程，许多以异
交植物为主的植物为了顺利繁衍后代，保存生命，向适应自交方向进化
[18]
。因此，花粉
活力与寿命、柱头可授性、花粉胚珠比、花期相遇机率以及杂交指数与主要传粉媒介等
成为必须关注的问题。

1.3 植物花粉的生活力检测花粉生活力是花粉所具有生长、萌发及发育的性能，是植物正常受精结实的关键因
素之一，花粉生活力常受自身遗传特性和外界诸多因素的影响，其生活力的大小对授粉
受精及育种效率具有重要影响。因此，在观赏植物的杂交育种工作中，在授粉前对花粉
进行生活力的测定，可以避免因使用低生活力的花粉而造成育种时间、成本的浪费。
花粉生活力一般采用离体萌发、染色法进行检测，花粉染色法具有操作方便、检测
快速等特点，但往往出现染不上色、出现假阳性等现象，仅适合部分植物的测定。染色
法常用的药剂有：TTC、I
2-KI、醋酸洋红、联苯胺等，TTC 应用较为广泛，在百合
[19]花粉和金银花
[20]花粉生活力检测中已经成功应用，李刚
[21]研究发现，芍药花粉生活力测定I2-KI 染色法相比 TTC 染色法结果更为精确。离体培养法能模拟柱头花粉萌发的环境，是检测花粉萌发率最准确的方法之一，常用的培养基多有蔗糖和硼酸组成，蔗糖的作用是提供合适的渗透压和花粉管形成所需能量，硼酸中的硼元素为微量元素，能促进花粉管的伸长，蔗糖、硼酸常用的浓度分别为 100～200 g/L、10～50 mg/L，不同植物花粉萌发所需要的培养基种类和浓度不同。王建
[22]对三色堇杂交育种研究表明：花粉萌发需要较高的蔗糖浓度，但高于 30 mg/L 有明显的抑制作用，三色堇花粉，一天中上午花粉萌发力最高。杂交育种经常遇到花期不遇、空间障碍等问题，有效贮藏花粉，延长花粉寿命，对植物杂交成败至关重要。长期保存花粉的必要条件就是低温处理，多数研究认为超低温保存(-80 ℃)是长期保持花粉生活力的有效方法
[23]，花粉在贮藏时最适湿度为 60 %以下，湿度过高或过低均会降低花粉的萌发率
[24]。花粉贮藏期间，花粉生活力与细胞内部的生理代谢活动、影响衰老的诸多因子紧密相关，而花粉中的保护酶类能够清除氧、自由基、延缓衰老，近年来的研究证实：保护酶活性的高低与花粉活力高度相关，是反映花粉活
力的重要指标
[16, 25-26]。综上所述，对野生堇菜的花粉生活力进行测定，探讨堇菜属植物花粉适宜的贮藏方法是堇菜属远缘杂交的基础工作。

1.4 远缘杂交研究进展
远缘杂交是指不同种间、属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交，可以打破物种(或科或属或种)之间的界限，使遗传物质之间的交换或组合成为可能，是创造新品种的有效途径[27]。远缘杂交是改变后代基因型和表型的有效途径，在作物的进化和遗传多样
性中发挥着重要作用[28]。在观赏植物的育种过程中，种间或属间杂交是遗传变异的最重要手段之一，观赏植物通过各种远缘杂交，在花色、花大小、叶型、抗病性等方面表现
出明显的**优势[29]，培育出具抗性和双亲花型花色等观赏性状较高的新品种[24]。目前远缘杂交育种已在观赏植物育种中成功应用，培育了菊花[30]、月季[31]、牡丹[32]、杜鹃[33]、百合[23]等观赏价值较高的新种质。远缘杂交在李子、杏、桃等核果类果树上也获得
了一些**
[34]。1.4.1 植物远缘杂交受精前障碍
远缘杂交在受精之前产生的各种交配障碍是导致不亲和性的主要原因，主要表现在：
（1）在杂交过程中，母本的育性、父本花粉的活力是杂交获得高结实率的关键因素；
（2）在花粉具备活力的情况下，亲缘关系较远的物种，花粉不能粘附在母本柱头上，或花粉不能萌发； （3）即使花粉能在柱头上萌发，花粉管伸长缓慢不能到达子房或伸长进入子房中途受到抑制，不能完成双受精[24]；（4）花粉管虽然能到达子房进入胚囊，但不能完成双受精[23]。受精前障碍在多数植物的远缘杂交中普遍存在，李辛雷[35]在菊属植物远缘杂交中研究发现，不亲和的主要原因为柱头上花粉粒粘附少，花粉萌发率低，花粉管顶端膨大、扭曲等原因，难以进入花柱。贺丹[36]等采用‘凤丹’和‘粉玉奴’远缘杂交，发现不亲和性主要表现为花粉萌发后，花粉管的生长受到阻碍，柱头产生一系列的胼胝质反应，最终使花粉管难以穿过柱头到达子房完成受精娄琦[37]在莺尾属植物种间杂交不亲和的研究中发现多数组合的花粉都能正常萌发，形成花粉管，但是花粉管不能
定向生长或生长缓慢，不能到达子房。受精前障碍利用荧光显微技术对植物远缘杂交花粉与雌蕊亲和性的研究已菊属[30]、百合[23]、紫薇[38]、杜鹃[39]等植物中报道，异源花粉很难在柱头上萌发，只有少数花粉萌发，而且花粉管生长异常，难以进入子房，导致受精后胚败育。

随着分子生物学技术的快速发展，多数研究表明决定自交不亲和的 S 基因在种间杂交亲和性中也起着一定的作用，一般认为花粉管在花柱中生长受限是由于 S 等位基因产物 S-RNase，抑制了花粉管延长和生长，不能够长至子房并完成双受精。因此，S 基因被认为是雌蕊自交不亲和性的决定因子[39-43]，调控自身不亲和性的基因对种间的不亲和性也有同样的影响。李智[44]等在蔷薇属植物远缘杂交研究结果表明，亲缘关系越近的其亲和率较高，杂交配对较易成功；亲缘关系相对较远的亲和率较低，配对不易成功。DING[34, 45]等发现采用高压静电场、60Coγ-射线、激光处理李、杏花粉和蕾期授粉处理，可以克服杂交不亲和性，提高结实率。切割柱头、化学药剂处理、嫁接柱头、改良授粉方式（重复授粉、混合授粉、花粉蒙导法）等一系列办法，在菊花[35]、百合[23]、郁金香[46]、蜡梅[47]等植物中已被证明是克服远缘杂交不亲和性的方法4植物远缘杂交中研究发现，不亲和的主要原因为柱头上花粉粒粘附少，花粉萌发率低，花粉管顶端膨大、扭曲等原因，难以进入花柱。贺丹[36]等采用‘凤丹’和‘粉玉奴’远缘杂交，发现不亲和性主要表现为花粉萌发后，花粉管的生长受到阻碍，柱头产生一系列的胼胝质反应，最终使花粉管难以穿过柱头到达子房完成受精。娄琦[37]在莺尾属植物种间杂交不亲和的研究中发现多数组合的花粉都能正常萌发，形成花粉管，但是花粉管不能定向生长或生长缓慢，不能到达子房。受精前障碍利用荧光显微技术对植物远缘杂交花粉与雌蕊亲和性的研究已在菊属[30]、百合[23]、紫薇[38]、杜鹃[39]等植物中报道，异源花粉很难在柱头上萌发，只有少数花粉萌发，而且花粉管生长异常，难以进入子房，导致受精后胚败育。随着分子生物学技术的快速发展，多数研究表明决定自交不亲和的 S 基因在种间杂交亲和性中也起着一定的作用，一般认为花粉管在花柱中长受限是由于 S 等位基因产物 S-RNase，抑制了花粉管延长和生长，不能够长至子房并完成双受精。因此，S 基因被认为是雌蕊自交不亲和性的决定因子[39-43]，调控自身不亲和性的基因对种间的不亲和性也有同样的影响。
李智[44]等在蔷薇属植物远缘杂交研究结果表明，亲缘关系越近的其亲和率较高，杂交配对较易成功；亲缘关系相对较远的亲和率较低，配对不易成功。DING[34, 45]等发现采用高压静电场、60Coγ-射线、激光处理李、杏花粉和蕾期授粉处理，可以克服杂交不亲和性，提高结实率。切割柱头、化学药剂处理、嫁接柱头、改良授粉方式（重复授粉、混合授粉、花粉蒙导法）等一系列办法，在菊花[35]、百合[23]、郁金香[46]、蜡梅[47]等植物中已被证明是克服远缘杂交不亲和性的方法。1.4.2 植物远缘杂交受精后障碍植物远缘**的不育性又称受精后障碍或**衰亡。其主要表现有：（1）受精后的幼胚不发育，发育不正常或发育中途停止；（2）**胚和胚乳不亲和或是由于胚乳
败育退化导致胚得不到营养而死亡，胚发育不良及**败育或不育等；（3）虽能得到具有**胚的种子，种子量少、种子畸形不能发育，或虽然能够发芽，但在苗期或成株前夭亡；（4）**植株不能开花，或因雌雄配子不育，造成**的结实性差，甚至完全不能结实[48-49, 24]。赵宏波[47]等对蜡梅属三个种进行人工种间杂交，观察到了花粉管的正常萌发，并观察到花粉管 4 d 时进入胚囊，初步判断种间杂交具备亲和性，但最终未收获果实，表明种间杂交还存在一定的障碍。王文鹏[24]对蜡梅科植物进行远缘杂交，发现在胚胎发育的各个阶段，均会发生胚乳发育异常和胚胎降解现象，蜡梅远缘杂交虽然收获了种子，但种子播种后，发芽率很低，但在苗期或成株前生长不正常大量夭亡，最终成苗率很低[50]。张睿婧[23]发现百合远缘杂交受精后障碍主要表现在精细胞与卵细胞不能结合、**胚不发育或者中途停止发育等现象。

近些年，随着生物技术的不断提升与成熟，胚抢救技术、细胞杂交融合技术等生物技术逐渐运用于植物的远缘杂交中，对克服远缘亲本杂交过程中不亲和问题提供了有效的帮助，在小麦[51]、百合[52]、菊花[30, 35]、鸢尾[37]、郁金香属[46]等植物上取得了一系列显著的研究进展。黄济明[53]采用先切柱头授粉后再对幼胚进行离体培养的方法，育成了大量百合的种间**Cheng[54]等进行了菊属菊花与菊花脑的种间杂交，通过胚培养获得**。Yang[45]等对李和杏的**胚胎挽救，进行丛芽诱导与增殖培养，获得大量的李和杏**的幼苗。野生堇菜为宿根草本，三色堇为二年生草本植物，其生态习性方面差别较大，存在着天然的生殖隔离，杂交亲和性低。目前仅有安芳[55]、朱蕊蕊[56]作了堇菜属植物种间杂交育种研究，关于堇菜属远缘杂交亲和性机制的系统性研究尚未见报道。堇菜属野生资源中含有许多栽培品种所缺乏的优良性状，如抗旱、抗病、耐热、匍匐及多花性等，通过远缘杂交，将野生堇菜的优良性状导入栽培品种，对堇菜属种质创新及品种改良具有重要意义。

1.4.3 杂交后代鉴定
远缘**鉴定的方法很多，包括形态学鉴定、细胞学鉴定、分子标记鉴定等。形态学鉴定的周期较长，工作量大，对于形态差异小的材料鉴定困难，可靠性低。细胞学鉴定程序繁琐，技术水平要求较高但分辨率不高，对于染色体短或结构差异较小的个体难以准确鉴定。随着分子生物学的快速发展，分子标记鉴定成为主要手段，从 DNA 水平
上来探究植物亲缘关系、遗传多样性及种质资源鉴定，方法相对简单、高效、成本低，不受外界环境、组织类别、发育时期影响等诸多优点被广泛应用。
（1） 形态特征
形态学鉴定法较为直观，简便、是最基本的鉴定方法。主要包括农艺性状（如株高等）、植物学性状（如株型、开花习性、花径等）、工艺性状和抗性（如抗塞性、抗病性等）等
[50]。能够根据杂交后代与亲本的遗传差异作出判断，但容易受到环境因素和主观意志影响，而且一般需要涉及花朵、果实等性状，在开花之前难以进行。通常不能仅依靠一种方法，而是要在形态观测的基础上，结合其它方法进一步鉴定**真实性
[23-24]。（2） 染色体鉴定染色体是遗传物质 DNA 的载体，对染色体形态和数目的研究是开展植物遗传育种
工作的前提和基础，染色体变异必然引起遗传物质发生变异，染色体变异研究主要在细胞分裂时期观察染色体的数目
[57]。目前进行染色体倍性鉴定常用的方法：（1）直接鉴定法，通过体细胞染色体计数法，这是当前应用最广，最简便的方法。应用较多的是常规压片法，一般取根尖、茎尖、叶片等细胞分裂旺盛且幼嫩的部位，通过细胞染色体数目分析其倍性、核型、确定其进化程度高低及亲缘关系远近。（2）间接鉴定法，主要包括流式细胞仪分析法、气孔大小及保卫细胞叶绿体数目鉴定法
[30]。流式细胞仪通过测定细胞的 DNA 相对含量，可以快速准确的鉴定出植物的染色体数目和倍性，可靠性高，
能在短时间内完成大量样品的测定。
（3） 分子标记鉴定近年来，一些 DNA 分子标记技术已迅速建立并广泛应用于作物遗传育种领域。分子标记辅助选择具有快速、准确且不受环境因素的干扰等优点，提高了育种的效率并缩短了育种周期[58]。DNA 标记技术广泛应用于构建植物遗传图谱、基因标记、基因组定位、鉴定杂交种的纯度等方面[59-60, 28]。目前，应用最普遍的分子标记方法包括简单序列重复(SSR)，具有高度多态性、基因组分布广泛、共显性和可再现性等特点，被用来区别纯合体和杂合体。序列相关扩增多态性(SRAP)，优点是操作简单、稳定性和重复性好，标记位点在基因组中分布相对均匀，易测序、便于克隆目标片段，通用性高，成本较低。扩增片段长度多态性(AFLP)，不需要提前知道 DNA 顺序等信息，检测效率高，由于扩增片段较短，其分辨率和重复性也高，以及不受物种限制，广泛应用于植物分子标记筛选、亲缘关系分析、遗传多样性的研究以及高密度遗传图谱的构建。DNA 标记技术在植物遗传学和育种学领域发挥了重要的作用[61]。

在植物育种中利用分子育种取得了显著的进展，M. Ejaz[28]利用 EST-SSR 引物成功地分离了 69 个芋头品种。安宗艳[44]利用 EST-SSR 标记研究了 57 份紫斑牡丹品种的遗传多样性，准确度高。李智[31]利用 SSR 技术，分析了 20 株月季杂交子代，鉴定出 17株真实杂交种。Cai. K[62]利用 SSR 标记研究了毛竹的遗传多样性、遗传距离、分类和进化。对三色堇而言，仅根据地理差异进行亲缘关系判断，并不十分准确。杜晓华[63]等研究了 33 个大花三色堇品种表型性状遗传差异。王涛[64]等采用 SRAP 标记研究了 43 份三色堇与角堇材料间亲缘关系及遗传多样性。李小梅[65]等利用 RSAP 研究了大花三色堇遗传多样性。
SSR 标记已在油菜[66]、甘蓝[67]、棉花[68]、玉米[69]、大麦[70]、辣椒[71]、芍药属[72]、海棠[60]等植物的真、假**以及种子纯度检测工作中应用。采用 SSR 标记技术对堇菜属杂交后代进行鉴定，通用性强、转化效率高，旨在为堇菜属种质创新提供理论依据。

1.5 本研究的目的意义
三色堇 (Viola tricolor) 属于堇菜科堇菜属植物，常作为二年生栽培的草本花卉，已成为早春布置花坛的主要花卉之一，在园林绿化方有很高的应用价值[63]。其花色丰富，花期长，但叶形单一，不耐热，抗寒性较差，严重制约了三色堇的应用推广。堇菜属（Viola）野生资源中裂叶堇菜（V.dissecta)、斑叶堇菜（V.variegata）叶型奇特，花期长，夏季开花，抗热性强，是优良的观叶植物；鸡腿堇菜（V.acuminata)株高可达 40 cm，叶片心形或卵形；西山堇菜（V. hancockii）繁殖快，适应性极强，花期可以持续到初冬，是极好的地被植物；早开堇（V.prionantha）、紫花地丁（V.philippica）花期早，抗寒性强。上述 6 个野生资源或叶形奇特，花色艳丽，富有观赏性，或抗逆性强，是堇菜属育种重要的种质资源，可用于花镜、镶嵌草坪、林下地被，极富前景。此外，6 个野生资源全草可入药，具有清热解毒，凉血止血功效，兼具食用和药用价值。新品种培育和品种改良是堇菜属种质创新的基础，一直是其科研的重要内容，我国不仅拥有丰富的三色堇栽培品种，而且还有得天独厚的野生资源优势，但我国的堇菜属
育种工作一直没有意识到野生种质在品种改良中的重要性，始终徘徊在品种间进行杂交，使得新品种的培育难有突破性进展[49]。远缘杂交是将有利性状转入目标材料从而获得新物种的有效途径，是培育植物新种质的重要方法，然而远缘杂交往往存在不亲和现象，研究亲本间的亲和性，克服生殖障碍，获得杂交种子是成功的关键。目前，有关堇菜属植物远缘杂交亲和性的研究尚未见报道。有鉴于此，本研究以 6 个野生堇菜为材料，对其核型进行了分析，研究了生殖生物学特性、繁育特性，在此基础上，优选相关的组合进行杂交，采用苯胺蓝染色荧光观察法、石蜡切片法观察分析了堇菜属杂交后花粉萌发、花粉管生长、受精及胚胎发育情况，并对杂交后代进行了鉴定，以期阐明堇菜属远缘杂交不亲和、**败育的生理机制，为堇菜属育种杂交亲本选配及克服其不亲和障碍提供依据，为培育出叶片奇特优美、花期长、耐热性强的三色堇新品种奠定理论基础。