很多的朋友想自己设计条件性基因敲除小鼠，或是想理解一下这方面的内容。这里做一个简单的介绍。希望对你有帮助。
条件性基因敲除小鼠 的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA 序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox（flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若 与控制Cre表达的其他诱导系统（比如CreERT2）相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre／loxP系统来源于噬菌 体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列（LoxP序列），含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。 令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间 DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也 叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个 LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟 Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/ 细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。
那 如何设计条件性基因敲除小鼠呢？这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一 般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般 是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序 列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候（各放一个LoxP在一个外显子的两侧），该外显子的碱基数目不能是 3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。如果一个外显子的碱基数目是 3N+1或3N+2，敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。筛选要敲除（Floxed）的外显子的时候，一般是从最上游的外显子 开始筛选适合敲除的外显子。需要注意的是，一般的DNA分析软件不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。95%以上的边界遵循gt/ag边界原则。 也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子。这个网站上的结果绝大部分是正确的。但也需要仔细核对。毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过 程，需要特别小心。前期做多少的考虑都不嫌多。这些原则只是对一般课题的考虑。特殊情况需要特殊处理。比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定 domain，或是如果一个基因有一个很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是3N，也可以对其进行敲除。
北京百奥赛图基因生物技术有限公司
条件性基因敲除小鼠 的设计利用了Cre/LoxP或Flipe/Frt原理。它们都是位点特异性重组酶系统。这里以Cre/LoxP系统为例。比如在待敲除的一段目标DNA 序列的两端各放置一个loxP序列，得到flox（flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠与带有细胞特异性表达Cre的小鼠交配繁殖，以获得在特定细胞里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。此外，若 与控制Cre表达的其他诱导系统（比如CreERT2）相结合，还可以对某一基因同时实现时空两方面的调控。
Cre／loxP系统来源于噬菌 体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两个组成成分：一个是一段长34bp的DNA序列（LoxP序列），含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。 LoxP的方向由中间这8个碱基决定。这段LoxP序列是Cre重组酶识别的位点。 令一个组成部分是Cre重组酶。它是由噬菌体编码的一种由343个氨基酸组成的蛋白。Cre可以介导两个LoxP位点的重组，从而引起两个LoxP之间 DNA序列的缺失。如果将Cre重组酶cDNA通过基因工程的手段置于组织或细胞特异性启动子之下，可以得到Cre组织/细胞特异性表达的Cre小鼠，也 叫Cre工具小鼠。 跟Flox小鼠交配之后，可以得到条件性基因敲除小鼠。
所谓Flox小鼠是指在某个基因的某个外显子两侧各放一个 LoxP序列。这段序列就是Flanked by LoxP，也就叫做Flox小鼠。这种Flox小鼠一般要通过设计构建打靶载体、胚胎干细胞重组、囊胚显微注射、和嵌合体小鼠传代来获得。这种小鼠跟 Cre工具小鼠交配，由于Cre的表达，介导两个LoxP位点序列的重组，从而敲除两个LoxP之间的序列。由于不同Cre工具小鼠的Cre表达有组织/ 细胞特异性，就可以达到在不同组织、细胞里特异性敲除目的基因的目标。比如上皮细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、心肌细胞、肠道、肺脏等。
那 如何设计条件性基因敲除小鼠呢？这里所说的设计主要是Flox小鼠的设计。所谓条件性敲除，是说除了特定细胞外，其它细胞里面没有任何的基因表达异常。一 般情况下，不要在第一个外显子前面放置LoxP序列。因为第一个外显子前面一般是启动子。放置LoxP序列有可能会破坏或改变启动子活性。条件性敲除一般 是敲掉最早引起移码突变的外显子。这样的话，最好不要敲除有起始密码子ATG的外显子。否则的话，基因可能会利用ORF内的ATG编码一个缺少部分N端序 列的蛋白，这个蛋白很可能有全部或部分野生蛋白的功能。在选择要敲除的外显子的时候（各放一个LoxP在一个外显子的两侧），该外显子的碱基数目不能是 3N，否则新基因pre-RNA拼接得到的mRNA不能产生移码突变。会产生一个与野生蛋白相比少了一段中间序列的新蛋白。如果一个外显子的碱基数目是 3N+1或3N+2，敲除这个外显子之后会产生移码突变，就可以达到基因敲除的目的。筛选要敲除（Floxed）的外显子的时候，一般是从最上游的外显子 开始筛选适合敲除的外显子。需要注意的是，一般的DNA分析软件不能确定内含子和外显子的边界，需要仔细核对。95%以上的边界遵循gt/ag边界原则。 也可以在Ensembl上查一个基因的外显子和内含子。这个网站上的结果绝大部分是正确的。但也需要仔细核对。毕竟基因敲除小鼠研发是一个时间比较长的过 程，需要特别小心。前期做多少的考虑都不嫌多。这些原则只是对一般课题的考虑。特殊情况需要特殊处理。比如，如果只是想敲除一个基因的某个特定 domain，或是如果一个基因有一个很大的外显子，这个时候即使这个外显子的碱基数目是3N，也可以对其进行敲除。
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