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01
Treg细胞概述
天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答/免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。
02
Treg细胞的常用的分子标记
抗原分子 表达及其功能
CD4+ 与MHC II类分子结合；主要表达在Th细胞上
CD25+ 表达于大部分Treg细胞上
CD3+ 表达于所有T细胞上，是TCR的组成部分
GITR 阴性标记分子
CTLA-4 结合CD80/CD86
CCR7 介导Treg细胞的迁移
FOXP3 是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素；是目前Treg细胞最敏感的标记
CD127 CD127是IL-7受体一部分，是新发现的Treg细胞标记分子
①CD25：研究表明，多种T细胞分子抗原可以参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但这种方式并不完全准确。
②FOXP3：目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg细胞的最敏感的标志。
它的表达及功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。
③CD127：最近发现通过表达CD4，CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联CD4，CD25和CD127的联合使用可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。
03
FOXP3流式检测方法
（1）实验材料
实验设备
流式上样管
混匀振荡器
离心机
移液器、Tips
流式细胞仪
所需试剂
细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）
FOXP3荧光标记抗体
溶血素：（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞
淋巴细胞分离液：若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测
固定剂和破膜剂：（eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）
其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等
（2）实验操作步骤
按照流式样品要求制备单细胞悬液。
按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。
每管加2ml 1×permeabilization buffer。
300g 室温离心5min,弃上清。
2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
300g 室温离心5min,弃上清。
加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。
加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。
适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。
注：在染胞内或胞核内的因子时，要对细胞进行固定和破膜，因此，与活细胞相比，在形态上会有一定变化，因此必须对所有细胞样本进行固定和破膜；若对Blank和染色细胞没做固定和破膜，在FSC/SSC图中对固定和破膜的样品细胞圈门时需要做一定调整。
01
Treg细胞概述
天然CD4+ CD25+ 调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周血单个核细胞（PBMC）2%～5%，约占外周CD4+T细胞的5～10%。该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答/免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。
02
Treg细胞的常用的分子标记
抗原分子 表达及其功能
CD4+ 与MHC II类分子结合；主要表达在Th细胞上
CD25+ 表达于大部分Treg细胞上
CD3+ 表达于所有T细胞上，是TCR的组成部分
GITR 阴性标记分子
CTLA-4 结合CD80/CD86
CCR7 介导Treg细胞的迁移
FOXP3 是Treg细胞发育成熟和发挥功能的必要因素；是目前Treg细胞最敏感的标记
CD127 CD127是IL-7受体一部分，是新发现的Treg细胞标记分子
①CD25：研究表明，多种T细胞分子抗原可以参与Treg细胞的特异性功能效应。传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。但这种方式并不完全准确。
②FOXP3：目前，Foxp3(forkhead box P3，Scurfin)是目前公认的Treg细胞的最敏感的标志。
它的表达及功能与调节性T细胞(regulatory T cells，TR细胞)密切相关。
③CD127：最近发现通过表达CD4，CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。联CD4，CD25和CD127的联合使用可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。
03
FOXP3流式检测方法
（1）实验材料
实验设备
流式上样管
混匀振荡器
离心机
移液器、Tips
流式细胞仪
所需试剂
细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）
FOXP3荧光标记抗体
溶血素：（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞
淋巴细胞分离液：若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测
固定剂和破膜剂：（eBioscience FOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Permeabilization Concentrate和Fixation/Permeabilization Diluent以1：3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）
其他试剂：Flow Cytometry Staining Buffer（00-4222）或PBS，Permeabilization Buffer（Cat.No 00-8333）等
（2）实验操作步骤
按照流式样品要求制备单细胞悬液。
按照流式表面染色方法标记CD3和CD4。缓冲液洗涤一次，离心完全弃上清。斡旋分散细胞。
加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定细胞。室温或四度避光孵育30-60min（小鼠样品最长可以四度固定18小时）。
每管加2ml 1×permeabilization buffer。
300g 室温离心5min,弃上清。
2ml 1×permeabilization buffer重悬细胞。
300g 室温离心5min,弃上清。
加100ul 1×permeabilization buffer 重悬细胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞内抗原抗体），室温避光孵育20min。
2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室温离心5min,弃上清。
加2ml 流式染色液，300g 室温离心5min,弃上清。
适量流式染色液重悬，即可上机检测。同行对照依照上述步骤进行。软件分析结果。
注：在染胞内或胞核内的因子时，要对细胞进行固定和破膜，因此，与活细胞相比，在形态上会有一定变化，因此必须对所有细胞样本进行固定和破膜；若对Blank和染色细胞没做固定和破膜，在FSC/SSC图中对固定和破膜的样品细胞圈门时需要做一定调整。
